Allele | csp | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Mutation Type | missense | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chromosome | 19 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coordinate | 5,797,716 bp (GRCm39) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base Change | T ⇒ C (forward strand) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Gene | Ltbp3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Gene Name | latent transforming growth factor beta binding protein 3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Synonym(s) | Ltbp2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chromosomal Location | 5,790,932-5,808,560 bp (+) (GRCm39) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MGI Phenotype |
FUNCTION: [Summary is not available for the mouse gene. This summary is for the human ortholog.] The protein encoded by this gene forms a complex with transforming growth factor beta (TGF-beta) proteins and may be involved in their subcellular localization. Activation of this complex requires removal of the encoded binding protein. This protein also may play a structural role in the extracellular matrix. Three transcript variants encoding different isoforms have been found for this gene.[provided by RefSeq, Jan 2010] PHENOTYPE: Homozygotes for a targeted null mutation exhibit craniofacial malformations including an overshot mandible and ossification of synchondroses. Mutants develop osteosclerosis of long bones and osteoarthritis, and, in some cases, high corticosterone levels. [provided by MGI curators] |
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Accession Number | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Mapped | Yes | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Amino Acid Change | Cysteine changed to Arginine | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Institutional Source | Beutler Lab | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Gene Model | not available | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AlphaFold | Q61810 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SMART Domains |
Protein: ENSMUSP00000080214 Gene: ENSMUSG00000024940 AA Change: C452R
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Predicted Effect | probably damaging
PolyPhen 2 Score 0.999 (Sensitivity: 0.14; Specificity: 0.99) |
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Meta Mutation Damage Score | Not available | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Is this an essential gene? | Probably nonessential (E-score: 0.198) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenotypic Category | Autosomal Recessive | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Candidate Explorer Status | loading ... | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single pedigree Linkage Analysis Data |
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Penetrance | 100% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alleles Listed at MGI | All alleles(5) : Targeted, knock-out(1) Gene trapped(3) Chemically induced(1) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Lab Alleles |
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Mode of Inheritance | Autosomal Recessive | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Local Stock | Embryos, gDNA | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MMRRC Submission | 010463-UCD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Last Updated | 2019-05-30 7:40 AM by Diantha La Vine | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Record Created | unknown | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Record Posted | 2007-10-10 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenotypic Description | The csp (craniofacial and skeletal malformation with paralysis) phenotype is characterized by watery eyes, hind leg paralysis and craniofacial malformations that are evident two weeks after birth. Kyphosis develops gradually, becoming prominent by the age of six months. Csp homozygotes suffer retarded growth at a young age, but grow normally at later stages. Histological analyses reveal abnormal formation of synchondroses. These phenotypes are observed both on the C57BL/6J background and in mice created by outcrossing to C3H/HeJ and backcrossing to the mutant stock.
The abnormalities observed in csp mice are similar to those of mice with impaired transforming growth factor-β (TGF-β) signaling in skeletal tissue (1).
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Nature of Mutation | The csp mutation was mapped to Chromosome 19, and corresponds to a T to C transition at position 2343 of the Ltbp3 transcript, in exon 9 of 28 total exons.
2328 GCCTTCAAGGAGATCTGCCCGGCTGGGAAAGGG
447 -A--F--K--E--I--C--P--A--G--K--G-
The mutated nucleotide is indicated in red lettering, and causes a cysteine to arginine substitution at residue 452 of the LTBP3 protein.
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Illustration of Mutations in Gene & Protein |
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Protein Prediction |
The 8-Cys motifs are unique to LTBPs, and mediate covalent binding through a disulfide bond to latent TGF-βs (see Background) (6;7). The NMR solution structure of the 8-Cys motif of fibrillin suggests that hydrophobic contacts may be important for LTBP recognition of latent TGF-β (8). As in all the LTBPs, only the third 8-Cys motif of LTBP3 forms disulfide bonds with latent TGF-β1 (9-11). Notably, the second 8-Cys motif has nine cysteine residues instead of eight, but the biological significance of this is unknown (9). A critical cysteine residue (C33) in latent TGF-β1 participates in disulfide bond formation with LTBP3 (6;10;11).
The csp mutation substitutes an arginine for the wild-type cysteine at residue 452 (C452R), in the predicted Domain 4.
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Expression/Localization | During embryonic development, mouse Ltbp3 mRNA is expressed throughout the body, with relatively high expression in the liver at embryonic day 13.5. Expression is also detectable in heart, central nervous system, pancreas, kidney, skin and walls of large arteries (2). In addition, Ltbp3 transcript is found in osteoblasts and periosteal cells of the calvarium (top of skull), mandible, and maxilla, and in cartilage and bone of lower extremities (2). The LTBP3 protein is targeted to the cell surface for secretion, a process that reportedly requires complex formation with TGF-β1 (10;12).
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Background | TGF-βs are dimeric polypeptide cytokine growth factors expressed and secreted by virtually every cell type. There are three TGF-β isoforms (1-3), each encoded by a separate gene whose expression is developmentally and spatially regulated. TGF-βs regulate cell growth and differentiation, and the synthesis, degradation, and remodeling ofthe extracellular matrix (ECM). They are expressed during embryogenesis and adulthood, and thus contribute to a wide variety of biological processes, including embryonic development, wound healing, angiogenesis, inflammation, and bone formation [reviewed in (13;14)]. TGF-βs generally promote tissue growth and differentiation in the embryo, but inhibit cellular proliferation in mature tissues (15). Dysregulated TGF-β signaling leads to cancers, particularly pancreatic and colon carcinomas (13;15).
TGF-βs are secreted from cells as latent large molecular mass complexes (LLCs) with three distinct components. TGF-β molecules are initially synthesized as precursor proteins (proTGF-β) comprised of a propeptide and the mature TGF-β (16). Even after cleavage, a non-covalent attachment binds the propeptide to the mature TGF-β, and in this state the propeptide is termed the latency associated peptide (LAP). The LTBPs form disulfide linkages with LAP at specific cysteine residues (6;7). Together, the LAP, LTBP and TGF-β form the LLC, and in this complex, TGF-β possesses no biological activity. LAP functions as an inhibitor of TGF-β, and dissociation from LAP is a crucial regulatory step in TGF-β activation. This dissociation may be stimulated by several proteases (plasmin, MMP-1, MMP-2), thrombospondin-1, integrins, acidic pH conditions, and reactive oxygen species [reviewed in (14)].
The role of LTBPs in TGF-β signaling is not yet clearly defined, although studies of LTBP1 suggest that they serve to localize TGF-β at appropriate sites in the ECM in a regulated manner, thereby modulating TGF-β bioavailability (17). ProTGF-β that fails to bind LTBP-1 is inefficiently secreted, and contains increased numbers of abnormal disulfide bonds, suggesting that LTBP-1 promotes correct folding and subsequent secretion of the LLC (18). Antibodies against LTBP-1 block TGF-β activation in a smooth muscle/endothelial cell coculture system (19), and prevent the TGF-β-stimulated endothelial-mesenchymal transition of mouse heart cultures (20). LTBP-1 may promote TGF-β bioavailability in part through crosslinking of LTBP-1 to the ECM (4;21). Both LTBP-1 and TGF-β are found in ECM microfibrils of fibroblasts (22) and skin cells (23). Moreover, inhibition of transglutaminase, a factor that mediates LTBP1-ECM crosslinking (24;25), reduces production of active TGF-β (26).
Once activated, TGF-β binds to three high-affinity cell surface receptors (types I, II and III) [reviewed in (13)]. The type III receptor is a nonsignaling receptor, and transfers its TGF-β ligand to either type I or type II receptors, which signal through their serine/threonine kinase domains and activate targets including the Smad transcription factors, MAP kinase and stress-activated protein (SAP) kinase pathways (13).
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Putative Mechanism |
Mislocalized and unchecked chondrocyte differentiation may underlie the premature ossification of synchondroses observed in Ltbp3-/- and csp mice (Figure 3). TGF-β1 has been shown to stimulate the expression of parathyroid hormone related protein (PTHrP, an inhibitor of chondrocyte differentiation) and inhibit chondrocyte hypertrophic differentiation (29;30). In Ltbp3-/- synchondroses, PTHrP levels are reduced relative to wild type, while the expression of Indian hedgehog (Ihh, a marker for chondrocytes committed to hypertrophic differentiation) was detected throughout LTBP3-null synchondroses. These data suggest that LTBP3 promotes TGF-β signaling to limit chondrocyte differentiation and synchondrosis ossification (28).
LTBP3-null mice develop age-dependent osteosclerosis with increased bone mass in the long bones and the axial skeleton (28). Similarly, transgenic mice expressing a dominant negative type II TGF-β receptor in osteoblasts acquire age-dependent osteopetrosis (31). Ltbp3-/- mice also develop osteoarthritis, and likewise transgenic mice expressing dominant negative type II TGF-β receptor in skeletal tissue (1), or targeted Smad3 mutants (32). These findings further support the postulate that reduced TGF-β signaling, particularly through Smad3, causes the skeletal phenotypes in Ltbp3-/- and csp mice.
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Primers | Primers cannot be located by automatic search. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Genotyping | Csp genotyping is performed by amplifying the region containing the mutation using PCR, followed by sequencing of the amplified region to detect the single nucleotide change.
Primers for PCR amplification
Csp(F): 5’-AGAAGCAACTGGGCAGAGGGACATAGC -3’
Csp(R): 5’-TGGTTCTCAACCTTCCCAGTGCCAC -3’
PCR program
1) 94°C 2:00
2) 94°C 0:15
3) 60°C 0:20
4) 68°C 1:00
5) repeat steps (2-4) 35X
6) 68°C 5:00
7) 4°C ∞
Primers for sequencing
Csp_seq(F): 5’- ACCCTCTGACCACACGCCTAAC -3’
Csp_seq(R): 5’- TGTAGCCCTGGCTGTCCTGGAACTC -3’
The following sequence of 923 nucleotides (from Genbank genomic region NC_000085 for linear DNA sequence of Ltbp3) is amplified:
6446 agaag caactgggca gagggacata gcaatgctca
6481 ggtcctgccc tccactccca cccctgcagc cgacaaacca gaggagaaga gcctgtgttt
6541 ccgccttgtg agcaccgaac accagtgcca gcaccctctg accacacgcc taacccgcca
6601 gctctgctgc tgtagtgtgg gtaaagcctg gggtgcccgg tgccagcgct gcccggcaga
6661 tggtacaggt gaggcagagg cacatcgtgg atgatgtagg gatgggacgg caagctgtgt
6721 acccgtccag gagttcactt gttgtggtgt ctgcatcttg accacagcag ccttcaagga
6781 gatctgcccg gctgggaaag ggtaccatat cctcacctcc caccagacgc tcaccatcca
6841 gggggaaagc gacttctccc tcttcctgca ccccgacggg ccacccaaac cccagcagct
6901 tcctgaaagc cccagccgag caccacccct cgaggacaca gaggaagaga gaggtctggc
6961 ttgatccaat aattccagat ccacagataa aactcagggg ctagccgggc gtggtggcgc
7021 acgcctttaa tcccagcact tgggaggcag aggcaggcgg atttctgagt tcgaggccag
7081 cctggtctac agagtgagtt ccaggacagc cagggctaca cagagaaacc ctgtcttgaa
7141 aaaaaagact catgggctaa ggcagtggtt tgaaacctgt aggttggaac ccctgggggc
7201 agggggtgtc acatatcaga tatcctgcct atcagatatt tacattagga ctcagaacag
7261 tagcaaaatt acagttatga agtagcaatt agatgatttt atggctgggg agtcatcaca
7321 acatgaggaa ctgtagaaaa ggggtggcac tgggaaggtt gagaacca
PCR primer binding sites are underlined; sequencing primer binding sites are highlighted in gray; the mutated T is shown in red text.
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References | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Science Writers | Eva Marie Y. Moresco | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Authors | Xin Du, Koichi Tabeta, Bruce Beutler |